巨噬細胞培養基和球體細胞培養基的制備方法

巨噬細胞培養基的操作步驟：

    1．實驗前三天，向每只小鼠腹腔內注入無菌硫羥乙酸肉湯1ml（勿注入腸內）。

　　2．引頸殺死動物，手提鼠尾將全鼠浸入70％酒精中3～5秒。

　　3．置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁。

　　4．再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時從兩側用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內充分流動。

　　5．用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內。

　　6．小心拔出針頭，把液體注入離心管中，250g 4℃離心10分鐘，去上清，加10 ml Eagle培養基。

　　7．計數細胞，每只小鼠可產生20～30×105細胞，其中90％為巨噬細胞。

　　8．為獲取3×105個帖附細胞/平方厘米，需接種2.5×106/ml。

　　9．為純化培養基細胞，去除其它白細胞，接種數小時后，去除培養液，用Eagle液沖洗1～2次后，再加新Eagle培養液置37℃CO2溫箱中培養。

球體細胞培養基的制備：

    1、瓊脂鋪底的培養基瓶：30ml無菌培養瓶，每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養基，冷卻，形成平坦底層后備用。

　　2、取生長狀態良好已連接成片的細胞，用彎頭吸管伸入瓶內，把細胞縱橫割劃成若干小區后，倒出培養液。

　　3、加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當細胞小區邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養液3~5 ml，用吸管把已松動的細胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養基底層的培養瓶中，置溫箱繼續培養，數日后便可生長成細胞球體。

　　4、換液：培養1~2日后，如需換液，微傾斜培養瓶，令培養基液集于培養瓶底角，停片刻，待球體細胞下沉后，吸除部分培養液，再補充新培養液。