大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒使用原理說明

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：10ng/L-360ng/L

使用目的：
本大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒用于測定大鼠血清、血漿及相關液體樣本中小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量。

實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。用純化的大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α（TNF-α），再與HRP 標記的腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α（TNF-α）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）濃度。

大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液20ml×1 瓶7 終止液6ml×1 瓶
2 酶標試劑6ml×1 瓶8 標準品（720ng/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板12 孔×8 條9 標準品稀釋液1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液6ml×1 瓶10 說明書1 份
5 顯色劑A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 張
6 顯色劑B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 個

標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟
1. 標準品的稀釋：本大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
360ng/L 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
180ng/L 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
90ng/L 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
45ng/L 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
22.5ng/L 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：大鼠腫瘤壞死因子α每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11.測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。

操作程序總結：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

注意事項
1．大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD 值大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

保存條件及有效期
1．大鼠腫瘤壞死因子α試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月