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干擾素生物學活性測定法

點擊次數:1581 更新時間:2011-08-23
 

本法系依據干擾素可以保護人羊膜細胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破壞的作用,用結晶紫對存活的WISH細胞染色,于波長570nm處測定其吸光度,可得到干擾素對WISH細胞的保護效應曲線,以此測定干擾素生物學活性。
試劑 (1)MEM或RPMI 1640 培養液取MEM或RPMI 1640 培養基粉末1袋(規格為1L),加水溶解并稀釋至1000ml,加青霉素105IU和鏈霉素105IU,再加碳酸氫鈉2.1g,溶解后,混勻,除菌過濾,4℃保存。
(2)*培養液量取新生牛血清10ml,加MEM或RPMI 1640培養液90ml。4℃保存。
(3)測定培養液量取新生牛血清7ml,加MEM或RPMI 1640培養液93ml。4℃保存。
(4)攻毒培養液量取新生牛血清3ml,加MEM或RPMI 1640培養液97ml。4℃保存。
(5)消化液取乙二胺四乙酸二鈉0.2g、氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.152g、磷酸二氫鉀0.2g,加水溶解并稀釋至1000ml,經121℃ 15分鐘滅菌。
(6)染色液取結晶紫50mg,加無水乙醇20ml溶解后,加水稀釋至100ml,即得。
(7)脫色液取無水乙醇50ml、乙酸0.1ml,加水稀釋至100ml。
(8)PBS取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.20g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g,加水溶解并稀釋至1000ml,經121℃ 15分鐘滅菌。
標準品溶液的制備 取人干擾素生物學活性測定的品,按說明書復溶后,用測定培養液稀釋至每1ml含1000IU。在96孔細胞培養板中,做4倍系列稀釋,共8個稀釋度,每個稀釋度做2孔。在無菌條件下操作。
供試品溶液的制備 將供試品按標示量溶解后,用測定培養液稀釋成每1ml約含1000IU。在96孔細胞培養板中,做4倍系列稀釋,共8個稀釋度,每個稀釋度做2個孔。在無菌條件下操作。
測定法 使WISH細胞在培養基中貼壁生長。按1︰2~1︰4傳代,每周2~3次,于*培養液中生長。取培養的細胞棄去培養液,用PBS洗2次后消化和收集細胞,用*培養液配制成每1ml 含2.5×105~3.5×105個細胞的細胞懸液,接種于96孔細胞培養板中,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養4~6小時。將配制完成的標準品溶液和供試品溶液移入接種WISH細胞的培養板中,每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳條件下培養18~24小時。棄去細胞培養板中的上清液。將保存的水泡性口炎病毒(VSV,-70℃保存)用攻毒培養液稀釋至約100CCID50,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培養24小時(鏡檢標準品溶液的50%病變點在1IU/ml)。然后棄去細胞培養板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室溫放置30分鐘后,用流水小心沖去染色液,并吸干殘留水分,每孔加入脫色液100μl,室溫放置3~5分鐘。混勻后,用酶標儀以630nm為參比波長,在波長570nm處測定吸光度,記錄測定結果。
試驗數據采用計算機程序或四參數回歸計算法進行處理。并按下式計算試驗結果

供試品生物學活性(IU/ml)=Pr×Ds×Es
Dr×Er
式中Pr為標準品生物學活性,IU/ml;
Ds為供試品預稀釋倍數;
Dr為標準品預稀釋倍數;
Es為供試品相當于標準品半效量的稀釋倍數;
Er為標準品半效稀釋倍數。
 

 
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